Vem äter vem? Viktigt att veta men svårt att studera.
Ute i naturen, på land, i havet och nere i marken kryllar det av liv och det existerar bara en lag- äta eller ätas! Att ta reda på vem som äter vem är viktigt i många ekologiska sammanhang. Av flera olika anledningar kan dock interaktioner mellan organismer från olika s.k. trofiska nivåer vara kryptiska och svåra att studera; individerna är kanske aktiva enbart på natten, de kan vara mycket små, snabba och/eller leva i en svårstuderad miljö (figur 1). Att exempelvis ta reda på vad ett litet leddjur som lever under tät vegetation eller en fisk djupt nere i havet äter är komplicerat, då deras levnadssätt gör dem svåra att studera.
Ett exempel där moderna tekniker kommer till nytta är inom skadedjursbekämpning i grödor. Våra jordbruks- och trädgårdsgrödor angrips ofta av skadedjur som kan orsaka stora skördeförluster. Skadedjur kan kontrolleras biologiskt av fiender, predatorer och parasitoider, som finns naturligt i odlingslandskapet (figur 1). Sådana arter bör bevaras och gynnas eftersom de kan förhindra utbrott av skadedjur och på så vis bidra till en minskad användning av kemiska bekämpningsmedel. För att gynna de naturliga fiender som är mest effektiva behöver vi ta reda på vilka som verkligen äter upp eller parasiterar på det skadedjur som vi vill kontrollera samt i vilken omfattning detta sker.
Figur 1. Organismerna i det schematiska systemet i figuren kan delas in i s.k. trofiska nivåer. Att känna till vilka interaktioner som äger rum mellan organismer från olika trofiska nivåer är viktigt. Rapsodlare kan exempelvis bli mindre beroende av kemisk bekämpning mot rapsbaggar genom att gynna och bevara effektiva naturliga fiender. Att ta reda på vilka predatorer och parasitoider som har störst potential att kontrollera rapsbaggar är emellertid komplicerat eftersom studieorganismerna är mycket små och lever bland tät vegetation. Om en predator är generalist och äter lite av varje, t.ex. hoppstjärtar från nedbrytarnivån eller en annan naturlig fiende, är det ännu svårare att bedöma effekten på skadegöraren.
DNA-teknik löser svårigheterna - varje organism har unika DNA-fragment
Hur kan man då gå till väga för att upptäcka kryptiska trofiska interaktioner? Ett framgångsrikt alternativ är att samla in organismer från dess naturliga miljö och undersöka vad de har i magen. På vår institution gör vi maginnehållsanalys av predatorer genom att söka efter DNA-rester från uppätna byten. Då bytet ofta är mycket mindre än predatorn och eftersom DNA dessutom bryts ner i magsäcken under matsmältningen måste man använda en metod som inte bara kan spåra mycket små mängder av nedbrutet DNA utan som också uppförökar DNA-resterna till ”hanterbara” mängder. Båda dessa egenskaper uppfylls av s.k. PCR (polymerase chain reaction)-teknik vilket gör den mycket användbar. PCR-teknik kan, förutom att avslöja predation, användas för att upptäcka många andra slags trofiska interaktioner (figur 2)
Figur 2. PCR-teknik kan användas för att upptäcka trofiska interaktioner som av olika anledningar är svåra att studera på annat sätt. I figuren ges exempel på tänkbara frågeställningar som kan besvaras med metoden; a) är vargspindeln en effektiv predator mot skadeinsekter i spannmål? b) vad äter mikroskopiskt små marklevande kvalster? c) vilka parasitoider har lagt ägg i rapsbaggens larver? Att direkt observera dessa interaktioner skulle vara mycket svårt eftersom studieorganismerna inte bara är små utan också lever bland tät vegetation eller nere i marken.
För att kunna detektera och uppföröka DNA-fragment från uppätna byten med PCR måste man ha tillgång till s.k. primers. Primers är korta artificiellt tillverkade DNA-bitar som specifikt skiljer ur och parar ihop sig med unika delar av bytets DNA. Primrarna, som alltid jobbar i par, kan designas så att de binder till DNA från en enda bytesart eller till en viss grupp av bytesdjur, och vill man studera om en predator äter många olika slags byten kan man använda flera primerpar på en gång. PCR är (som det engelska namnet antyder) en kedjereaktion som utförs av enzymet DNA-polymeras. Kedjereaktionen upprepas flera gånger i följd och efter varje enskild cykel kommer det DNA man siktat in sig på (i det här fallet bytets) att ha dubblerats. När alla upprepningar är gjorda har det skett en exponentiell uppförökning av bytets DNA från några få till miljontals kopior. Under PCR-analysen uppförökas inte allt DNA från bytet utan bara ett litet fragment som innehåller de unika sekvenser som primrarna binder till. Längden av fragmentet är känd vilket är viktigt längre fram i analysen. PCR illustreras schematiskt i figur 3.
Figur 3. Figuren visar schematiskt hur det går till när ett DNA-fragment från exempelvis ett uppätet byte uppförökas med PCR. Reaktionen styrs av att provet växelvis hettas upp och kyls ned.
Från frågeställning till resultat
Figur 4 illustrerar det generella tillvägagångssättet då man vill avslöja om ett skadedjur på jordbruksgrödor ätits av en predator. Vill man undersöka vad en fisk har ätit, om en skadegörare är parasiterad eller från vilka organismer en mygga har sugit blod är arbetsgången principiellt den samma. Metoden har nyligen också börjat användas för att spåra konsumtion av svamp- och växtmaterial.
Figur 4.
a) Havre och korn angrips ofta av havrebladlöss som kan orsaka stora skördeförluster. Vargspindlar är vanliga predatorer i dessa grödor men äter de verkligen havrebladlöss? Frågan kan besvaras genom att söka efter rester av havrebladlusens DNA i spindlarnas maginnehåll. Hos havrebladlöss finns ett DNA-fragment med unika sekvenser som är 331 baser långt och det är denna lilla bit som vi försöker detektera. Predatorerna fångas direkt i sin naturliga miljö och får alltså vara helt ostörda ända fram till insamlingstillfället. Individerna läggs sedan på is för att DNA från uppätna byten ska bevaras så intakt som möjligt. b) DNA utvinns från hela individer eller, om predatorn är mycket stor, enbart från själva magsäcken. I båda fallen får man en blandning av DNA från både predatorn och bytet. Bytets DNA finns ofta i mycket, mycket små mängder och för att få mer DNA att arbeta med måste det uppförökas med PCR. c) För att avgöra om ett prov innehåller bytets DNA kan man använda två metoder; 1) Den första varianten som illustreras här innebär att de färdiga PCR-proverna appliceras i små hål på en gel som innehåller ett DNA-bindande färgämne som lyser i ultraviolett ljus. Över gelen läggs ett elektriskt fält och DNA, som är en negativt laddad molekyl, kommer att röra sig från minus- mot pluspolen. Detta kallas elektrofores. Parallellt med PCR-proverna vandrar alltid en lösning som innehåller DNA-fragment av olika kända längder. Korta DNA-fragment rör sig snabbare och vandrar längre i gelen än långa fragment och därför kommer denna lösning att bilda en s.k DNA-stege. När elektroforesen är klar belyser man gelen med ultraviolett ljus och om spindeln innehöll havrebladlusens DNA kommer det att synas som ett vitt lysande band. DNA-stegen används som referens för att kontrollera bandets storlek. Om bandet är av förväntad längd, i detta fall 331 baser, vet vi att predatorn har ätit havrebladlöss och vi kallar det för ett positivt resultat. Om ett band av rätt storlek uteblir har spindeln inte ätit just det byte som vi sökte och vi kallar det för ett negativt resultat. 2) En annan variant är att läsa av innehållet i provet redan under själva PCR-processen och analysen sker därför samtidigt som multipliceringsprocessen sker. Den metoden kallas därför realtids-PCR. I den metoden använder man också fluoroserande färg som ökar i styrka i takt med att antalet producerade kopior ökar och mätningarna sker efter varje kopieringscykel. Med den här metoden sker kopiering och avläsning i samma process. För att säkert avgöra att det man har i sitt prov verkligen är bytets DNA gör man en så kallad smältkurvsanalys av DNA-produkten där smältkurvans utseende speglar DNA-fragmentets unika utseende. Så, om DNA-produkten inte kommer från bytet, dvs om det blivit fel i processen, kommer smältkurvan inte att ha det utseende vi förväntar oss.
Hur bedömer man om en predator är effektiv?
Den typ av PCR som beskrivs här är inte kvantitativ, dvs. man kan inte avgöra hur många byten en predator har konsumerat. Vi kan trots det bedöma hur effektiv en predator är genom att uppskatta hur lång tid som bytets DNA kan detekteras i maginnehållet. Predatorerna matas på laboratorium och får sedan smälta bytet under olika lång tid. Efter en viss tidpunkt kommer bytets DNA att vara så pass nedbrutet att det inte går att detektera ens med PCR-teknik. Om man inte känner till denna s.k. detektionstid är det omöjligt att veta om ett positivt resultat är en måltid från flera dagar sedan eller om predatorn åt strax före den fångades. Om detektionstiden är kort, ett fåtal timmar, vet man att en predator som testas positiv med hög sannolikhet åt bytet strax före infångandet. Om en stor procentandel av alla insamlade predatorer blir positiva och den kända detektionstiden är relativt kort har man hittat en effektiv predator med potential att kontrollera skadedjuret.
Maginnehållsanalys med PCR är populärt, men se upp med två typer av felkällor!
Fler och fler forskare använder sig av DNA-teknik för att avslöja olika slags trofiska interaktioner. Förutom att få direkta bevis för att interaktioner mellan specifika organismer verkligen äger rum har tekniken många andra fördelar; det går t.ex. snabbt att analysera många prover och man kan detektera mycket, mycket små mängder DNA eftersom PCR är en väldigt känslig metod. Många forskare runt om i världen behärskar PCR-teknik och när art- och gruppspecifika primers har designats och publicerats kan de användas fritt av vem som helst.
När man undersöker trofiska interaktioner med PCR finns det dock två huvudsakliga felkällor. Den ena är s.k. sekundär predation som innebär att en predator inte själv har ätit bytet vi söker men ändå testas positiv efter att ha konsumerat en annan predator som i sin tur innehöll det aktuella bytet. Den andra felkällan beror på en begränsning hos själva metoden. PCR-teknik kan påvisa närvaro av ett bytes DNA i en predators mage, men det går inte att avgöra om bytet var dött eller levande när det åts upp. Positiva reaktioner som är resultatet av sekundär predation och asätning innebär att en predators effektivitet som bekämpare av skadedjur kan överskattas. I båda fallen har predatorn inte aktivt dödat ett byte och har därför inte minskat bytespopulationen. Felkällornas eventuella betydelse måste bedömas noggrant inför varje enskild studie.
Personal:
Barbara Ekbom, Anna Lundhagen, Karin Hill, Cecilia Remén, Carol Högfeldt, Anna-Karin Kuusk
Publikationer:
Kuusk A-K, Cassel-Lundhagen A, Kvarnheden A and Ekbom B. 2008. Tracking aphid predation by lycosid spiders in spring-sown cereals using PCR-based gut-content analysis. Basic and Applied Ecology, 9:718-725
Kuusk A-K and Agustí N. 2008. Group-specific primers for DNA-based detection of springtails (Hexapoda: Collembola) within predator gut contents. Molecular Ecology Resources, 2008, 8:678-681
McMillan S, Kuusk A-K, Cassel-Lundhagen A and Ekbom B. 2007. The influence of time and temperature on molecular gut content analysis Adalia bipunctata fed with Rhopalosiphum padi L.Insect Science, 14:353-358
Cassel-Lundhagen A, Öberg S, Högfeldt C, Ekbom B (2009) Species-specific primers for predation studies of the pollen beetle, Meligethes aeneus (Coleoptera, Nitidulidae). Molecular Ecology Resources DOI: 10.1111/j.1755-0998.2009.02540.x
Finansiärer:
Formas