Optimering av fertilitet hos avelshingstar

Reaktiva syreföreningar (ROS) finns i alla vävnader i kroppen och även i sperma, där de produceras av skadade och döda spermier, från cytoplasmiska rester i omogna spermier, och även av leukocyter och cellfragment. Höga nivåer av ROS är associerade med infertilitet hos människor, men troddes tidigare inte orsaka skador i hingstsperma, på grund av att de antioxidativa system som finns i hingstens seminala plasma (glutation peroxidas, superoxiddismutas och katalas) skulle neutralisera ROS. Dessutom kan spädningsvätskor för sperma ha antioxidativ aktivitet. Dock kan yttre faktorer påverka ROS-produktionen hos enskilda hingstar, vilket överstiger den neutraliserande förmåga antioxidanter har och orsaka den kraftigt varierande överlevnad hos hingstsperma som noterats under lagring. Kyld utspädd hingstsperma som transporterats över natten i frigolitlådor, har gett mycket varierande resultat i AI. Det finns en stor variation mellan hingstar och mellan ejakulat i den tid som spermier behåller sin befruktningsförmåga och viabilitet, varierande från en timme till 2-3 dagar. Dessutom är det bara ~ 30% av hingstarna som producerar ejakulat som fryser bra, resten producerar varierande proportioner av levande spermier (eller inga alls) efter upptining. En ökning av ROS-produktionen antas ske under frysförvaring, vilket kan orsaka lipidperoxidering i spermiemembranen samt kromatinskador. En sådan ökning kan också förekomma under kylförvaring, trots tidigare rapporter om motsatsen.

Syftet med detta projekt var därför att undersöka ROS-produktion i hingstspermaprover, både kylförvarade och frysta och att fastställa möjliga sätt att neutralisera produktionens negativa effekter. Inledningsvis utreddes möjligheten att mäta ROS med en luminometer. Fördelen med en sådan metod skulle vara att den är transportabel och därmed kan användas på olika stuterier för att mäta ROS-produktion i sperma omedelbart efter samlingen. Det var dock inte möjligt att etablera denna analys vid SLU och i stället utvecklades en flödescytometrisk analys med fluorescerande färgämnen. Denna analys har använts för att analysera ROS-produktion i 45 kylda lagrade spermadoser (15 hingstar, 3 ejakulat per hingst) och 37 upptinade frysta prover (10 hingstar).

I de upptinade proverna var spermiernas viabilitet korrelerad med andelen levande spermier som inte producerade ROS (P <0,05), och viabiliteten var också korrelerad med progressiv motilitet (P <0,01). I de kyllagrade AI-doserna varierade ROS-produktionen kraftigt mellan hingstar (intervall 14-50%, median 25%). Det fanns dock inget uppenbart samband mellan ROS-produktion och förlust av viabilitet eller motilitet, vilket tyder på att den spädningsvätska som använts (INRA96) kan neutralisera de skadliga effekterna av ROS på spermier. Intressant nog visade det sig att ROS inte verkar orsaka lipidperoxidering i hingstspermiernas membran. Detta resultat står i kontrast till resultat för galtspermier, som skadas av ROS och kan bero på att hästens kost (och därmed hästens sädesvätska) har hög nivå naturliga antioxidanter, eller användning av spädningsvätska som innehåller höga halter av antioxidanter. En möjlig positiv roll för låga andelar av sädesvätska upptäcktes i experiment där sädesvätskan sattes tillbaka till SLC-separerade spermier. Dessa utvalda spermier hade högre progressiv motilitet än icke-separerade spermier, och denna ökades ytterligare, om än tillfälligt, genom att sätta tillbaka sädesvätskan till en slutkoncentration av 5% till lösningen med framseparerade spermier. En koncentration av 20% eller mer av sädesvätskan hade däremot en skadlig effekt på spermiernas rörlighet. Detta resultat kräver ytterligare utredning eftersom det skulle kunna vara ett bra sätt att förbättra motiliteten i kylda eller upptinade spermiedoser för AI, om sädesvätskan tillsattes direkt innan AI.

Funktionaliteten hos hingstspermier som hade preparerats med Single Layer Centrifugering (SLC)-metoden mha Androcoll ™-E, som tidigare utvecklats vid SLU, testades genom intracytoplasmisk spermieinjektion. Spermierna kunde initiera normal utveckling när de injicerades i äggceller från häst och normala blastocyster producerades. När sperma från lågfertila hingstar användes, hade en högre andel av de oocyter som injicerats med SLC-utvalda spermier en utveckling till blastocyststadiet än de som injiceras med spermier som preparerats med densitetsgradient. SLC-metoden skalades upp så att större volymer ejakulat kan bearbetas. Hela ejakulatet kan nu behandlas i 4-8 50mL-rör, beroende på ejakulatets volym. Den uppskalade metoden användes för att preparera utvalda spermiedoser för artificiell insemination (AI), med resulterande dräktigheter. Ejakulat från fem problemhingstar bearbetades med SLC och användes för AI, vilket resulterade i dräktighet i 50% av inseminationerna, jämfört med 0-20% för tidigare oselekterade spermiedoser.

En fullskalig fertilitetsstudie med AI pågår för att undersöka olika aspekter av fertilitet hos SLC-selekterade spermier. I ett samarbetsprojekt med en grupp i Belgien, användes SLC-selekterade spermier för frysförvaring med Botucrio, en ny spädningsvätska innehållande amider, som tros orsaka mindre osmotisk stress för spermier än glycerol och därför mindre ROS-produktion. Den progressiva motiliteten hos SLC-selekterade spermier efter upptining var i genomsnitt 13% bättre än hos oselekterade spermier preparerade för frysning på vanligt vis, vilket var ett utmärkt resultat (M. Hoogewijs, opublicerade observationer). Ytterligare arbete krävs för att optimera frysningsprotokollet för SLC-selekterade spermier och för att testa deras fertilitet efter AI, men SLC-tekniken verkar ge verkligt hopp för att förbättra frysningsprotokollen i hästavelsbranschen.

Ytterligare undersökningar som härrör från dessa resultat är att fortsätta att undersöka de eventuella positiva effekterna av små mängder av sädesvätska för att tillfälligt stimulera spermiernas rörlighet och för att skydda spermierna under nedfrysning. Användningen av SLC-selektion som ett sätt att förbättra spermieöverlevnaden efter nedfrysning är även relevant för branschen, tillsammans med nya tillsatser till frysmediet, såsom amider. Fördelarna med SLC-selektion för att förlänga spermiernas viabilitet under kylförvaring, och även i det inseminerade stoet, kräver ytterligare studier i AI-försök.