SLU-nyhet

Kraftfull genteknik på väg att bli verklighet i växter

Publicerad: 20 april 2018
moss.jpg

Forskare vid SLU har för första gången lyckats applicera en genteknik utvecklad på jästsvampar på växter. Detta öppnar dörren för kraftfulla verktyg för att bland annat snabbt studera hela nätverk av gener involverade i växtspecifika processer som fotosyntes, utveckling och symbioser med andra organismer.

Molekylärbiologiska tekniker har de senaste 40 åren gjort det möjligt att studera funktionen hos enskilda gener. En grundbult i metodiken är att klippa bort, ”knocka”, eller överuttrycka gener och observera konsekvenserna. Det vanligaste sättet att introducera nya gener i en cell är att klistra in dem i en plasmid, en liten cirkulär DNA-molekyl, som sedan transformeras in i värden.

En grundförutsättning för allt sådant arbete är så kallade modellorganismer; labbets ”försöksdjur”. En ideal sådan organism är välstuderad med helt sekvenserat genom, växer och replikerar sig snabbt, trivs på enkla tillväxtmedium, tål långvarig lagring osv. För bakterier är den vanligaste modellorganismen E. coli, medan vanlig bagerijäst länge har använts för att studera grundläggande biologiska funktioner i högre organismer (svampar, djur, växter).

Behov av nya modellorganismer

Ett problem med att studera gener i dessa enkla modellorganismer är att alla gener helt enkelt inte är möjliga att uttrycka i jäst eller bakterier. Exempelvis kräver gener som involverar fotosyntes en modellorganism från växtriket som värd. Vanliga molekylärbiologiska tekniker har traditionellt varit ineffektiva i växter, bland annat för att plasmiden tenderar att integreras med växtens eget DNA och förändras på olika sätt. Genmodifieringen blir därför inte beständig.

zheng.jpg
Guo-Zhen Hu i mosslabbet. Foto: Cajsa Lithell.
muddermossa.jpg
Muddermossa är en lovande modellorganism på vilken flera tekniker framtagna för jästsvampar kan appliceras. Foto: Cajsa Lithell
supression.jpg
Schematisk beskrivning av hur skyttelplasmider kan kartlägga många gener involverade i samma process. Förmågan att växa på fruktos i mörker slås ut och cellerna transformeras med ett genbibliotek i skyttelplasmider. Plasmiden räddas ur alla de celler där förmågan återfås. Ofta löser flera olika sorters gener samma problem vilket ger ledtrådar till ett helt nätverk av processer.
plasmider.jpg
Celler som inte tagit upp plasmiden (t.h.) kan inte bilda histidin och växer inte. Celler som har tagit upp den (transformerats, t.v.) växer som vanligt. Foto: Hans Ronne.

Muddermossan lovande

Ett genombrott i det hänseendet kom 1997 när det visade sig att det gick att knocka gener i muddermossa, Physcomitrella patens, på samma sätt som i jästsvampar. Muddermossans ställning som modellorganism stärktes ytterligare 2009, när en forskargrupp som nu är verksam vid SLU upptäckte att plasmider som introduceras i mossan inte integreras i växtens DNA eller stuvas om utan förblir intakta. Därmed kan de användas för att överuttrycka intressanta gener, men än viktigare är att de kan återisoleras från mossan (räddas) och därmed användas som s.k. skyttelplasmider.

Skyttelplasmider

En skyttelplasmid är en plasmid som kan flyttas mellan organismer - från E. coli till muddermossa och tillbaka till E. coli, exempelvis – utan att förändras under tiden. Mossan kan då transformeras med ett helt genbibliotek av sådana plasmider, d.v.s. kopior av alla gener från den växt man vill studera. De transformerade mossceller som börjar uttrycka de intressanta generna sparas. Skyttelplasmiden räddas tillbaka till E.coli och kan sekvenseras, studeras och långtidsförvaras i frys.

Nätverk av gener nystas upp

En annan poäng med skyttelplasmider är så kallad gendossuppression, som kan användas för att hitta och studera gener som är involverade i samma biologiska process. En gen med känd funktion knockas i jäst, vilket slår ut funktionen. Jästcellerna transformeras sedan med ett genbibliotek, och alla celler som återfår den förlorade funktionen sparas. Plasmiderna överförs till E. coli och studeras. Ofta visar det sig att många olika gener som fungerar i samma process kan motverka effekten av den knockade genen, vilket gör det möjligt att analysera hur ett helt batteri gener fungerar tillsammans i en process. Skyttelplasmider i mossa skulle möjliggöra denna kraftfulla teknik även i växter.

Nya selektionsmarkörer

Ett nyckelsteg i varje transformering är selektion; den mekanism som sållar bort de celler som inte transformerats från dem som har det. Den vanligaste metoden är antibiotikaresistens; plasmiderna bär med sig en resistensgen och de transformerade cellerna placeras på ett medium innehållande antibiotika. De som växer, bär med sig plasmiden. Metoden har dock sina begränsningar; dels är antalet resistensgener begränsat vilket hämmar möjligheten till selektion i flera dimensioner samtidigt, och dels kan antibiotikan ha okänd påverkan på cellerna trots att resistensgenen låter dem växa. Av dessa skäl är det oftast fördelaktigt att istället använda auxotrofa markörer. Dessa baseras på cellinjer där förmågan att syntetisera vissa aminosyror eller nukleotider slagits ut och därför bara växer på medium som berikats med dessa. Plasmiderna bär med sig gener som ersätter (komplementerar) de knockade generna.

Auxotrofa markörer i mossa

I en ny studie från institutionen för skoglig mykologi och växtpatologi på SLU demonstreras för första gången att auxotrofa markörer går att använda för molekylär kloning av gener i muddermossa. Professor Hans Ronne har lett arbetet.

- Vi har tidigare kunnat se att flera tekniker utvecklade på jäst, som att manipulera enskilda gener med homolog rekombination och överuttryck med stabila plasmider, fungerar i muddermossa. I den här studien visar vi att det även är möjligt att använda auxotrofa markörer, vilket gör att vi nu har möjlighet att utveckla ett sofistikerat system för skyttelplasmider i denna modellorganism, säger Hans.

Hans och hans kollegor knockade genen PpHIS3, som är essentiell för mossans förmåga att bilda aminosyran histidin. De modifierade cellerna kunde därefter bara växa på medium innehållande histidin. 

Många tänkbara selektionsmarkörer

- När vi transformerade cellerna med en plasmid innehållande en intakt PpHIS3-gen, växer de som vanligt på medium utan histidin, säger Hans. Det gör denna gen kan användas som selektionsmarkör i muddermossa. Vi kunde dessutom knocka en annan gen, som behövs för syntesen av aminosyran tryptofan. Vi tror därför att det är möjligt att på detta sätt framställa ett stort antal selektionsmarkörer, långt fler än de fyra markörer för antibiotikaresistens som i dagsläget är tillgängliga för arbete med muddermossa.

När forskarna plockade ut plasmiden ur muddermossan efter selektionen, kunde de också konstatera att den var identisk med plasmiden som transformerats in i mossan, d.v.s. den integreras inte i mossans genom eller utsätts för rekombination.

- Dessa fynd gör sammantaget att vi tror att muddermossa kan användas för att klona gener genom komplementering med plasmidbibliotek. Det vore i så fall ett stort framsteg, eftersom det bland annat skulle göra det möjligt för oss att utföra gendossuppression på intressanta växtspecifika gener och funktioner. Det har gjorts många gånger i jäst, men avsaknaden av lämpliga skyttelplasmider har hittills gjort det omöjligt i växter. Vi hoppas att våra upptäckter nu öppnat denna dörr.

Text av Mårten Lind


Kontaktinformation

Professor Hans Ronne

Institutionen för skoglig mykologi och växtpatologi
018-673223, hans.ronne@slu.se

Sidansvarig: cajsa.lithell@slu.se